De zestiende eeuw kende een grote omwenteling in de maatschappij op wereldlijk en kerkelijk gebied. De Beeldenstorm van 1566 was onder meer de ontlading van de spanningen binnen de katholieke kerk. In 1572 was de opstand tegen Spanje een feit dat het convent aan den lijve ondervond door plundering en verwoesting van de abdijgebouwen. In 1579 werd de abdij grotendeels in de as gelegd. De abdij beschikte over een onderkomen in ’s-Hertogenbosch voor het geval hun eigen gebouw hun onvoldoende veiligheid bood. Na een vluchthuis of refugie achter het stadhuis (voor het eerst vermeld in 1392) had de abdij na 1506 een dergelijk verblijf in de Sint-Jorisstraat verworven. Gedurende de hectische jaren van de opstand verbleven de kloosterlingen beurtelings in de restanten van hun oude abdij en in ’s-Hertogenbosch.
De wapenstilstand tussen Spanje en de jonge Republiek der Verenigde Nederlanden (1609-1621) gaf Berne en de Bossche bisschoppen even lucht. De abdij wist in 1613 het achtste patronaatsrecht in handen te krijgen, dat van Lithoijen, aangekocht van de Abdij van Sint-Remigius in Reims. De bisschoppen van ’s-Hertogenbosch konden de ideeën van het Concilie van Trente uitvoeren, die de grondslag vormden voor een grondige hervorming van de kerk, de Contrareformatie. In deze relatief rustige jaren konden ze hun bisdom opnieuw opbouwen en zelfs nieuwe kloosterorden naar de stad halen. Ook de abdij probeerde zich een plaats in de stad te verwerven. Een van de kloostergebouwen die er leeg kwam te staan was het huis van de Fraters, het Gregoriushuis van de broeders van het Gemene leven. De kartuizers van Vught hadden eveneens hun oog op deze gebouwen laten vallen. Na een strijd tussen de bisschop en zijn kapittel kon laatstgenoemde partij het fratershuis in 1623 toewijzen aan de abdij. In 1625 werd de koop bezegeld. De abdij had zich inmiddels tot Brabantse abdij laten omdopen.

De rust was echter van korte duur. In 1629 viel de stad in handen van de stedendwinger Frederik Hendrik. De prelaat van de abdij, abt Moors, was een van drie personen die namens de stad het verdrag van overgave ondertekende. Alle mannelijke kloosterlingen moesten de stad verlaten en de gemeenschap verhuisde grotendeels naar het Slotje in Heeswijk, een verstrekt huis bij de hoeven van Bernheze, dat in gebruik was bij de pastoor van Heeswijk. Het plakkaat van 1636 dwong alle katholieke geestelijken de Meierij te verlaten De abdijleden kregen in 1637 toestemming zich te vestigen in de restanten van het oude abdijcomplex, maar een jaar later konden ze terugkeren naar het Slotje in Heeswijk.