De Sint-Jan werd van collegiale kapittelkerk verheven tot bisschoppelijke kapittelkerk. De bisschop kreeg directe zeggenschap over het omgevormde kapittel. Dit leidde tot spanningen, omdat hiermee de autonomie van het kapittel werd aangetast. Om in een inkomen te voorzien kreeg de Bossche bisschop de Abdij van Tongerlo toegewezen. Hij werd daarvan qualitate qua abt, zodat hij over het abtsinkomen kon beschikken. De abdij was op zijn zachtst gezegd niet gecharmeerd van deze zogeheten commanditaire abt, omdat ze geen zeggenschap had in zijn benoeming en de financiële lasten van de bisschop moest dragen. Naast verzet van de kapittel en de grote abdijen, kreeg de eerste bisschop, Franciscus Sonnius, geïnstalleerd in november 1562, ook tegenwerking te verduren van de adel en functionarissen van het oude bisdom Luik, die hun posities bedreigd zagen.
Als vervolg op dit eerste decennium van opbouw werd Sonnius, die in 1570 bisschop van Antwerpen werd, opgevolgd door Laurentius Metsius. Na de beroeringen van de Beeldenstorm van 1566 boden de troepen van de hertog van Alva bescherming aan de kerk, zodat de nieuwe bisschop ongehinderd zijn zetel kon innemen. De eerste diocesane synode in 1571 leidde tot een herindeling van het bisdom. De 194 parochies werden ingedeeld in tien dekenaten: ’s-Hertogenbosch, Orthen, Oss, Geertruidenberg, Hilvarenbeek, Eindhoven, Helmond, Heusden, Zaltbommel en Geel. In de jaren zeventig verloor het bisdom de parochies in de Hollandse gebieden en de Bommelerwaard voor een groot deel. Ook in 's-Hertogenbosch kregen Calvinistische elementen de overhand en in 1577 nam de bisschop de wijk naar het zuiden. De komende jaren namen de aartsdiaken (Coeverincx), de officiaal (Tijpoets) en de zegelaar (Van Grinsven) de zaken waar.
Het plotselinge overlijden van Crabeels in 1592 leidde tot de uitoefening van de bisschoppelijke taken door kapittelvicaris Coeverincx totdat eind 1593 Ghisbertus Masius als vierde bisschop aantrad. Zijn langdurige aanblijven (tot 1614) en de tijdelijke wapenstilstand (1609-1621) leidden tot stabiliteit in het bisdom waardoor de Contrareformatie haar werk kon doen. Masius ondernam vele visitatiereizen naar zijn parochies en hield in 1612 de tweede diocesane synode. Met betrekking tot de parochies in het graafschap Megen en het Land van Ravenstein bestond er een langdurig geschil met het bisdom Luik over de geestelijke jurisdictie. In 1613 eindigde het conflict met Megen: vanaf dat jaar werd erkend dat de geestelijke jurisdictie over het graafschap toebehoorde aan de bisschop van ’s-Hertogenbosch. In het Land van Ravenstein werd het gezag van de Bossche bisschop aanvankelijk evenmin erkend. Na het Staatse intermezzo tussen 1618 en 1627 kreeg de katholieke kerk er haar oude rechten terug en ressorteerde het ook in de praktijk de volgende jaren onder het bisdom van ’s-Hertogenbosch. Het Land van Cuijk, Boxmeer en Oeffelt vielen al vanaf 1559 onder het nieuw opgerichte bisdom Roermond. Zij vormden het dekenaat Grave met vanaf 1602 als zetel Cuijk. Na de val van Grave in 1602 kwamen stad en land onder Staats bestuur, hetgeen leidde tot een verbod tot openlijke uitoefening van het katholieke geloof. Het zelfstandige Boxmeer en het Kleefse Oeffelt konden daarentegen katholiek blijven.
Door de dood van Ophovius kwam de bestuursmacht van het bisdom in handen van het kathedraal kapittel in de persoon van de kapittelvicaris Hendrik van den Leemputte. Deze situatie duurde tot 1647 toen Joseph Bergaigne tot bisschop was benoemd. Hij kon echter alleen nog maar toegang krijgen tot het dekenaat Geel, dat in Spaanse handen was gebleven. In de rest van zijn bisdom was Van den Leemputte namens hem bestuurder. Dit gold ook nog na de dood van de bisschop in 1656.
Uit angst voor de groeiende Staatse invloed in de Meierij opteerde de heer van Ravenstein voor nieuwe aansluiting bij het bisdom Luik. De paus stond dit in 1658 officieel toe. Een veertigtal jaar later, in 1697, volgde de nieuwe heer van Megen dit voorbeeld door de parochies in zijn gebied onder het dekenaat Ravenstein te plaatsen. Daardoor viel het graafschap opnieuw onder het bisdom Luik (in zijn nieuwe vorm).